Лабораторная диагностика Африканской чумы свиней
Для лабораторных исследований при подозрении на африканскую чуму свиней ветеринарный врач осуществляет отбор проб от свиней любой половозрастной группы, в зависимости от эпизоотологических данных и клинических показаний (неожиданная гибель нескольких животных неустановленной этиологии или превышающих технологическую норму). Количество проб берут от всех павших (заболевших), но не менее, чем от 3-х животных при массовой гибели. Структура проб: «полный набор», включая пробы крови, лимфатических узлов, паренхиматозных органов, костной ткани, трубчатую кость с мозгом (в случае отсутствия органов или их аутолиза).
Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших, или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г - селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентеральные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.
Отбор проб для серологических исследований. Пробы крови отбирают из полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи.
Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами.
Для обнаружения антигена африканской чумы свиней применяют реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток костного мозга (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), содержащих эритроциты и последующем обнаружении гемадсорбции ставят в вирусологических лабораториях. Для этого культуру клеток, выращенную на стеклянных пластинках из покровных стекол в пробирках (чашках Карреля), заражают экстрактами суспензий органов и кровью и через 24, 48, 72, 96 и 192 часа после инокуляции культуру клеток просматривают под световым микроскопом на наличие гемадсорбции. В положительных случаях наблюдают гемадсорбцию эритроцитов на пораженных вирусом клетках в виде ягоды «малины».
Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час.
Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.
Для обнаружения антигена и антител против вируса африканской чумы свиней применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант) основанный на взаимодействии иммобилизированных на поверхности лунок планшет специфических к вирусу АЧС иммуноглобулинов со специфическими антигенами АЧС и последующим выявлением комплекса «антиген-антитело» специфическим к вирусу АЧС конъюгатом антител, меченным пероксидазой хрена (коньюгат ПХ-АЧС). Пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена, в результате чего в лунках развивается окраска субстрата, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе. В случае отсутствия антигена, коньюгат ПХАЧС (т.е. ПХ) удаляется отмывочным раствором, и окраска отсутствует.
При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.
Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флуоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени.
Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения используемого прибора.
Полезные ссылки
